项目文章 | 时空组学测序助力破解NSMP子宫内膜癌复发之谜

子宫内膜癌（EC）是最常见的妇科癌症之一。约7%–15%的早期EC患者和40%–70%的晚期EC患者发生复发，5年生存率为20%-25%。EC的分子分型包括POLE超突变（POLEmut）、微卫星高度不稳定（MSI-H）/错配修复缺陷（MMRd）、无特定分子特征（NSMP）和TP53异常（p53abn）亚型。其中NSMP EC约占所有原发EC的50%，且缺乏特定分子特征、个体间存在较大的异质性，因此需要进一步研究。

为了探究NSMP EC复发的潜在机制，本研究首次通过snRNA-seq、ST和mIHC系统性阐明了复发（R）患者与未复发（NR）患者的原发肿瘤组织微环境（TME）的差异。本研究旨在揭示R和NR NSMP EC患者肿瘤的TME及细胞间相互作用特征，为NSMP亚型的复发机制提供新见解，并提出潜在治疗靶点。

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1.NSMP EC的细胞景观

对10例NSMP EC的单细胞样本进行测序，获得了122,506个单细胞图谱，可归类为上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞、浆细胞和NK细胞。这项研究发现，无论是在NR肿瘤还是R肿瘤中，各种免疫细胞的比例最低。此外，与NR肿瘤相比，R肿瘤中成纤维细胞和内皮细胞数量相对较多。并对2例样本进行了空间转录组学测序，组织被划分为四个区域：“上皮富集区”、“内皮富集区”、“基质富集区”和“免疫富集区”。

2. R肿瘤上皮细胞表现出更高的干性特征评分

通过InferCNV分析确认恶性上皮细胞，同时也发现，NR样本的肿瘤细胞反而具有更高的拷贝数变异（CNV）评分，进一步分析发现，NR组上皮细胞中CD274表达相对较低且肿瘤浸润淋巴细胞水平相对较高，这可能意味着更好的免疫状态和预后。

上皮细胞被分为8个簇，Epi_C2和Epi_C3为R肿瘤中的主要上皮细胞，而Epi_C0为NR肿瘤中的主要上皮细胞。R肿瘤具有相对较高的干性特征评分。Epi_C2在所有上皮细胞亚型中拥有最高的干性特征评分。TCGA-UCEC数据库显示Epi_C2与EC患者中较差的总生存期（OS）相关。

转录因子（TFs）分析推断，在R肿瘤中与维持癌细胞干性、促进治疗耐药性和免疫抑制相关的TFs上调。此外，R肿瘤的上皮细胞似乎表现出JAK-STAT和p53通路激活增加，而缺氧和PI3K通路在NR样本中似乎被激活。参与IL6_JAK_STAT3信号通路的PTPN2和CD9在Epi_C2中表达较高。PTPN2和CD9与较差的OS相关。GeneMANIA分析显示，CD44作为潜在的癌症干细胞标志物，是PTPN2和CD9的常见微环境调节因子。CD44在Epi_C2和R肿瘤中表达较高。空间点图显示，CD44在R肿瘤区的表达显著高于NR肿瘤区。

3. MMP11+ LEF1+ CAFs促进了R肿瘤的血管生成和肿瘤细胞生长

内皮细胞被分为静脉、尖端、毛细血管、淋巴和动脉五种亚型，其中尖端内皮细胞与血管生成和上皮-间质转化（EMT）密切相关，并具有最高的血管生成评分。成纤维细胞则被分为4群，MMP11+ LEF1+ CAFs是其中与EMT程序关联最为紧密的亚群之一。拟时序分析提示，平滑肌细胞可能是这些促肿瘤CAFs的来源，ROR1的上调则标记了成纤维细胞向促肿瘤表型的分化轨迹。

4. CD4+ T细胞在NSMP EC中处于应激反应状态

CD4+ T细胞被细分为初始T细胞、增殖T细胞、调节性T细胞（Treg）、记忆T细胞和应激反应T细胞（TSTR） 等亚群。为评估CD4+ T细胞的功能状态，计算了所有CD4+ T细胞的激活、细胞毒性、抑制性和应激反应评分。在R和NR肿瘤中均观察到高应激反应评分，表明T细胞可能处于应激反应状态且功能受损，且在R肿瘤中也观察到相对较高的抑制性评分。热休克蛋白（HSPs）成员HSPA1A和HSPA1B在TSTR细胞中表达较高。空间点图显示了CD4与HSPA1A/HSPA1B在NR和R肿瘤中的共定位。

5. CHI3L1+ TAMs与子宫内膜癌较差的OS有关

根据巨噬细胞基因表达的特征，将其分为MRC1+、SPP1+、MKI67+、IL17RA+、CHI3L1+和FGFR2+ TAMs。值得注意的是，NSMP EC中的巨噬细胞表现出较高的M2型巨噬细胞样评分。这一发现snRNA测序数据中发现的免疫抑制亚群的显著富集现象一致，尤其是已知与肿瘤进展和免疫逃避有关的MRC1+、SPP1+和CHI3L1+ TAMs。

在TCGA-UCEC数据库中，CHI3L1+ TAMs较多的患者具有较短的OS。空间转录组发现CD163和CHI3L1的共定位在R肿瘤中比NR肿瘤更强，且肿瘤内及周围显著富集。HALLMARK信号通路分析推断CHI3L1+ TAMs富含脂肪酸代谢和氧化磷酸化，SPP1+ TAMs显著富集血管生成、EMT和缺氧。

6. 细胞间通讯揭示了高表达SPP1的巨噬细胞在TME中关键作用

CellChat分析显示，SPP1⁺巨噬细胞与Epi_C2上皮细胞及CD4+ T细胞之间存在增强的相互作用。且mIHC和空间转录组学分析，进一步表明了二者的共定位现象。机制上，SPP1+ TAMs可能通过SPP1-CD44轴，同时促进CD4+ T细胞的应激状态并维持上皮细胞的干性，从而重塑抑制性微环境、促进肿瘤细胞的增殖与迁移。

体外实验进一步验证：建立了SPP1的敲低和过表达巨噬细胞，SPP1敲低巨噬细胞使Jurkat细胞中应激标志物 HSP70 和耗竭标志物 LAG3、PD-1 的蛋白水平下降，HSPA1A、HSPA1B mRNA表达水平也降低；而SPP1过表达巨噬细胞则使上述应激和耗竭标志物升高，加入抗CD44处理后这些指标表达下降；SPP1敲低巨噬细胞使上皮细胞干性标志物CD44、CD133蛋白水平下降；SPP1过表达巨噬细胞则呈相反趋势，而抗CD44处理后可逆转SPP1过表达带来的升高。成球实验进一步显示，SPP1过表达巨噬细胞能够维持Ishikawa细胞的干性。证实了SPP1⁺巨噬细胞促进T细胞应激和维持上皮干性的功能。

本研究整合了snRNA-seq、空间转录组学和多重免疫组化，阐明NSMP EC中的TME及其复发机制。结果显示，NSMP EC中免疫浸润减少，免疫抑制细胞（包括SPP1+巨噬细胞和Tregs）增加。与未复发患者相比，在复发患者的原发性肿瘤组织中，观察到更多具有高干性评分的上皮细胞。在NSMP EC中，尖端内皮细胞和MMP11+ LEF1+CAFs与血管生成和EMT相关，CD4+ T细胞处于应激反应和功能受损状态。有趣的是，发现了一组以SPP1表达为特征的TAMs，其通过SPP1-CD44轴促进CD4+ T细胞应激和维持上皮细胞干性来重塑肿瘤微环境，从而促进肿瘤细胞的增殖和迁移。本研究推进了NSMP EC复发相关TME的机制性探索，并为患者个性化治疗奠定了基础。

参考文献:

Xinhui Yuan, Zhengyao Zhai, Chuyu Jing, Wei Zhang, Wenjuan Tian, Yulan Ren.The Characteristics of Tumor Microenvironment by the Single Cell Profile in Endometrial Cancer of no Specific Molecular Profile (NSMP) Subtype Object Identifier (DOI)