文献解读 | 单细胞联合TCR测序挖掘新抗原特异性TCR，助力免疫治疗疗效预测

实体瘤占全部癌症死亡的九成，而以 T 细胞受体（TCR）改造自体 T 细胞的工程化治疗，长期卡在同一个瓶颈：如何在不误伤正常组织的前提下，锁定只由肿瘤细胞产生的新抗原，并把真正识别它的那条 TCR 找出来。传统路径依赖体外 T 细胞功能试验，或用抗原多聚体从混合细胞群中分选，但肿瘤微环境造成的耗竭与功能障碍，常让“能打仗”的细胞在体外“打不动”，而表面活化标志物富集又难免混入大量无关的旁观者 T 细胞。美国国立卫生研究院（NIH）国家癌症研究所（NCI）外科分部的 Steven A. Rosenberg、Frank J. Lowery、Sri Krishna 等换了一条思路：先读懂细胞的转录状态，再回头认领它的抗原特异性。研究团队把 55 条新抗原特异性 TCR 克隆型（NeoTCR）逐一映射到 10 例转移性实体瘤、45,676 个肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的单细胞转录组上，发现新抗原反应性 CD4⁺ 与 CD8⁺ TIL 并不散落各处，而是高度汇聚于两个终末分化的功能障碍状态（CD4⁺ C1 与 CD8⁺ C6），并共享一套以 CXCL13、CXCR6、PDCD1、TIGIT、ENTPD1、LAG3、TOX 为核心的分子程序。由此提炼的 NeoTCR4（40 基因）与 NeoTCR8（243 基因）特征，仅凭转录状态就能“认出”抗肿瘤 TCR：在 4 例新样本中前瞻性预测并实验验证 73 条 TCR，37 条（50.7%）被确认为新抗原、肿瘤相关抗原或自体肿瘤反应性，覆盖 KRAS、TP53、PIK3CA 等驱动基因新抗原以及 MAGEA6、HPV16-E4 等非突变抗原。这项发表于《Science》的工作，为转移性实体瘤的 TCR 发现提供了一条无需体外扩增与功能筛选的“转录组直读”路径，也让单细胞转录组联合 TCR 测序成为可复刻的研究起点。

以单细胞转录组联合 TCR 测序，将新抗原反应性 TCR 克隆型回溯映射到转移性实体瘤 TIL 的转录状态，定义 CD4⁺ 与 CD8⁺ 新抗原反应性 TIL 的共享分子特征，并验证该特征可仅依据转录状态前瞻性预测新抗原/肿瘤反应性 TCR，为实体瘤 TCR 工程化治疗提供可规模化落地的抗原特异性识别工具。

A-seq）+ 单细胞 TCR 测序（scTCR-se

1.转移性实体瘤中的 TIL 存在哪些转录状态，肿瘤内扩增的克隆与血源移行的旁观者克隆在状态上有何本质区别？

2.新抗原反应性 CD4⁺ 与 CD8⁺ TIL 是否共享同一套功能障碍分子程序，这套程序由哪些基因构成？

3.基于该程序构建的特征，能否在不依赖体外扩增与功能筛选的前提下前瞻性预测抗肿瘤 TCR，其敏感性与特异性如何？

10× Genomics 5′ 单细胞转录组测序（scRNA-seq）、单细胞 TCR 测序（scTCR-seq）与 CDR3β 克隆分型、UMAP 无偏聚类与拟时序分析、单细胞基因集富集分析（scGSEA）与 ROC 评估、串联小基因（TMG）及肽段库抗原筛选、4-1BB 流式分选与 TCR 重建、TCR 转导与 IFNγ ELISpot 验证、PDX 与类器官共培养。

1. 45,676 个 TIL 绘出 12 种转录状态，肿瘤扩增克隆集中于终末分化功能障碍群

研究纳入 10 例转移性实体瘤患者的手术切除病灶，涵盖乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌与直肠癌，分选 CD4⁺ 与 CD8⁺ TIL 后采用 10× Genomics 5′ 平台同步完成单细胞转录组与 TCR 测序，共获得 45,676 个 TIL 的转录图谱。UMAP 无偏聚类界定出 12 个转录状态（C0–C11）：既有活化态（C0、C3、C10），也有组织驻留记忆态（TILRM，C2、C4）与 CD4⁺ 调节性态（TILTreg，C9）；其中 C1 与 C6 分别与既往黑色素瘤、膀胱癌单细胞研究中报道的功能障碍 CD4⁺ 与 CD8⁺ 群共享基因特征，拟时序轨迹进一步显示这两个群的细胞处于最分化末端（Fig.1A-B）。

将 23,712 个 TCR 克隆型叠加到状态图谱后可以看到，全部克隆中 83.2% 为未扩增的单克隆，寡克隆扩增主要发生在终末分化的 CD8⁺ C6、驻留记忆 C4 与效应记忆 C7；700 个针对流感、CMV、EBV 的公共病毒 TCR 细胞分散于多种状态，以外周血来源特征最明显的 C4 与 C7 居多。按克隆来源分层则更为清晰：血源富集克隆偏好 C7，血源扩增克隆遍布多数状态但少见于 C1、C6 与 C9，而肿瘤内扩增克隆高度集中于 CD8⁺ C6 与 CD4⁺ C1，双扩增克隆则多见于 C0 与 C7（Fig.1C-H）。

2. 54 条 NeoTCR 回溯定位：CD4⁺ C1 与 CD8⁺ C6 共享一套功能障碍程序

将实验已确认的325个新抗原反应性T细胞回投到T细胞地图后，绝大多数抗癌T细胞集中在两个“分化但功能失调”的状态——CD4⁺ C1和CD8⁺ C6，其中84.3%落在C1/C6，CD4⁺克隆有91.3%在C1/C6，CD8⁺克隆有78.5%在C6（图2A）；以直肠癌肝转移肿瘤4323为例，其四个主导NeoTCR所代表的140个单细胞几乎都落在CD8⁺ C6（91.4%），而实验验证真反应的NeoTCR细胞（黑色）也主要落在C6，不反应的TCR（紫色）则散在别处（图2B）；进一步从肿瘤4323的C6状态新预测并重建8个TCR，其中7个对TMG3或TMG6有反应，说明C6里还能继续捞出新的抗癌TCR（图2C）；这些新TCR对突变肽反应强、对野生型肽反应弱，证明它们认的是突变新抗原而非正常蛋白（图2D）；把所有已知NeoTCR合并后，CD8⁺抗癌TCR（n=281）高度集中在C6，CD4⁺抗癌TCR（n=261）高度集中在C1（图2E）；按病人拆分看，多数病人的抗癌T细胞也主要落在C1/C6，只有少数克隆落在C1/C6以外（灰色柱）（图2F）；这些NeoTCR细胞高表达的代表基因如CXCL13、ENTPD1、ADGRG1、HMOX1等，其高表达区域正好对应C1/C6（图2G）；基因热图进一步显示，CD4⁺和CD8⁺ NeoTCR细胞共同下调IL7R、CD44、KLF2、LDH1、ANXA1、S100A10、RGCC等干性/记忆相关基因，而CD8⁺ NeoTCR还表达GZMA、GZMB、GZMK、IFNG、PRF1等杀伤基因，以及LAG3、HAVCR2（TIM3）、ENTPD1（CD39）等疲惫标志和ITGAE（CD103）组织驻留标志（图2H）。总体上，图2表明：实验确认的抗癌T细胞集中在CD4⁺ C1和CD8⁺ C6这两个疲惫分化状态；从C6还能继续捞出并验真新的突变特异性TCR；这些细胞共享一套“疲惫但抗癌”的基因程序，为后续NeoTCR4/NeoTCR8特征提供了依据。

3. 从特征到预测：73 条 TCR 前瞻验证，50.7% 命中

基于上述表达谱，研究逐步缩减基因列表并以 ROC 曲线评估，最终确定 40 基因的 NeoTCR4 特征用于识别 CD4⁺ 反应性 TIL、243 基因的 NeoTCR8 特征用于识别 CD8⁺ 反应性 TIL，两者 AUC 均大于 0.9。值得注意的是，即使刻意剔除 CXCL13、PDCD1、ENTPD1、ITGAE、TIGIT、TOX、LAG3、HAVCR2、GZMK 这 9 个经典活化/耗竭标志，特征仍保持 AUC 大于 0.8 与 0.9 的性能，提示这套功能障碍程序并不只由少数“熟面孔”构成，而是包含一批功能尚未阐明的基因。

真正的考验来自前瞻性验证。研究在 4 例转移性结肠腺癌样本（4393、4394、4400、4421）中，仅按特征打分挑选候选克隆，重建并合成 73 条 TCR（42 条 CD8⁺、31 条 CD4⁺），随后针对 156 至 485 个自体候选新抗原、高表达肿瘤相关抗原以及自体 PDX/类器官逐一筛选。结果 37 条（50.7%）显示反应性，其中 CD8⁺ TCR 的命中率为 61.9%，CD4⁺ TCR 为 35.4%。被识别的靶点既包括 FAM63Amut（p.D460N）、FUT1mut、PCNTmut（p.P2122L）、ANO9mut、FLNBmut、UHRF2mut、ESRP1mut、THOC6mut 等新抗原，也包括驱动基因 KRAS 的 G12V 与 G13D 新表位、非突变肿瘤相关抗原 MAGEA6，以及仅对自体肿瘤/类器官反应、对候选新抗原阴性的“孤儿”受体（Fig.3A-G、表1）。

从预测效率看，据此估算每测序 1000 个 TIL，中位可捕获 17.5 个 CD8⁺ NeoTCR 克隆与 46.4 个 CD4⁺ NeoTCR 克隆；NeoTCR⁺ 细胞在不同样本中占全部 TIL 的 0.1%–9.1%。即便是在测序深度下看似“未扩增”的单克隆（如样本 4323 的 TCR10），也被实验证实具有新抗原反应性，说明特征判读并不依赖克隆丰度（Fig.3I）。

表1 四例前瞻性验证样本的 TCR 预测与实验结果

本研究以单细胞转录组联合 TCR 测序，把 55 条新抗原特异性 TCR 克隆型精确回溯到 10 例转移性实体瘤的 45,676 个 TIL 上，首次系统定义了 CD4⁺ 与 CD8⁺ 新抗原反应性 TIL 共享的分子程序，并提炼出可直接使用的 NeoTCR4（40 基因）与 NeoTCR8（243 基因）特征。研究证明，真正被肿瘤抗原驱动的克隆集中于终末分化的功能障碍状态，与血源旁观者克隆在转录层面清晰可分；更关键的是，这套特征在 4 例新样本中实现了 50.7% 的前瞻性预测命中率，覆盖驱动基因新抗原、非突变 TAA、致癌病毒抗原与自体肿瘤反应性孤儿受体，完成了从“回溯相关性”到“前瞻可预测”的证据闭环。研究不仅为转移性实体瘤的 TCR 工程化治疗提供了低成本、可规模化的抗原特异性识别方案，也提示瘤内功能障碍程序本身即是抗肿瘤 T 细胞的“分子身份证”；对于希望开展同类研究的团队，单细胞转录组与单细胞 TCR 测序的联合设计，正是复刻这一范式的核心起点。

参考文献：

Lowery FJ, Krishna S, Yossef R, et al. Molecular signatures of antitumor neoantigen-reactive T cells from metastatic human cancers. Science. 2022 Feb 25;375(6583):877-884. doi: 10.1126/science.abl5447