项目文章 | 肝脏驻留的CD3 +巨噬细胞在小鼠乙型肝炎模型中HBV清除的潜在作用

肝脏是一种特殊的器官，具有独特的免疫特性和对食源性抗原的耐受性。新生儿接触HBV后会发生慢性感染；而急性感染通常发生在成年人身上，这表明肝组织微环境中的免疫细胞也可以有效地对抗病毒。关于急性HBV感染机制的研究很少。在这项研究中，我们在急性HBV模型小鼠的肝脏中发现了兼具有T细胞和巨噬细胞特征的巨噬细胞群，并揭示了这些巨噬细胞在HBV清除中发挥重要作用。此外，我们证实这个群体是在病毒特异性T细胞和抗体存在的情况下从巨噬细胞衍生而来。这一发现凸显了肝脏微环境中抗病毒免疫反应的复杂性。

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1. HBV小鼠肝脏微环境中免疫细胞的单细胞分析

所有HBV小鼠肝脏中的免疫细胞被鉴定为24个簇(图1B ,左)，包括B、巨噬细胞、CD8 + T、CD4 + T、NK、粒细胞、树突状细胞( DC )、NKT、Treg、MAIT和浆细胞(图1B ,右)，并通过星戈勒软件进行注释。热图用于显示用于细胞定义的基因(图1C )。它们在不同小鼠体内的分布情况见图1D。标志性基因包括Cd79a ( B和Plasma)、Csf1r ( Macrophage )、Cd8a ( CD8 + T )、Cd4 ( CD4 + T )、Ncr1 ( NK )、S100a8 ( Granulocyte )。

2. HBV小鼠模型中髓系来源的细胞组成

单核细胞源性巨噬细胞( MoMs )分为3个亚群(簇2、5和13)，组织驻留kuffer细胞分为4个亚群(聚类0、6、10、12)。粒细胞也分为3个亚群(簇1 , 7和11)，而DC分为4个亚群：c DC-1 ( cluster 3 )、c DC-2 ( cluster 8 )、p DC-1 ( cluster 4 )和p DC-2 ( cluster 9 ) (图S2A )。在HBV快速清除小鼠中，单核细胞、粒细胞- 1和cDC - 1的百分比在第3天急剧增加(图2E )。此外，在第35天，pDC - 1在HBV快速清除模型中比第3天大，这表明它不是病毒清除的关键群体。其中，巨噬细胞具有高度异质性。所有的MoMs簇都具有较高的Cx3cr1，表明它们是由外围迁移而来的种群。MoM - 1中Fn1升高，提示其为单核细胞早期分化的亚群。C1qa在Kupffer cluster 1 ~ 4中的高表达表明它们是组织定居细胞。Kupffer-cluster 1细胞被发现是表达高水平APOC1和MRC1的M2样巨噬细胞，在CHB肝脏中积累并有助于组织修复。S100a8和S100a9富集的Kupffer - cluster 3被认为是免疫抑制细胞。有趣的是，Cd3e和Cd3g在Kupffer - cluster 2 ( Red arrow )中高表达。含有Spic基因的Kupffer - cluster 4亚群几乎只存在于HBV快速清除模型(图2F和G)中，提示其为红髓巨噬细胞。在35天的HBV快速清除和持续感染小鼠的肝脏中，该簇的比例显著增加(图2F )，但其数量仅在35天的HBV快速清除小鼠中增加(图2G )。由于这种快速清除模型中的HBV清除通常发生在建模后的第3周至第4周，因此该簇可能是参与清除HBV的新型巨噬细胞群。

3. HBV清除过程中肝内CD3 + Kupffer细胞的鉴定

值得注意的是，除了Clec4f，Kupffer-cluster 2还高表达T细胞基因CD3e和CD8a (图3A )。这些细胞也显示CD3g，CD3d，Adgre1 ( F4 / 80 )和Fcgr1 ( CD68 )表达增加，但不表达CD4 (图3B )。尽管如此，仍有可能由于细胞粘附而检测到这些CD3 +巨噬细胞。为了排除这种现象，我们进一步分析了细胞的线粒体基因，其表达量在2.5 % ~ 5.0 %之间，表明它们不是黏性细胞。然后我们通过共聚焦显微镜观察分选的CD3 + Kupffer细胞，发现其与巨噬细胞相似，呈现不规则的形态，并与CD3和CD8共表达F4 / 80 (图S3A )。为了进一步验证sc RNA - seq在肝脏中发现的CD3 + Kupffer亚群，对快速清除小鼠的血清HBsAg进行动态监测，并于第5周处死小鼠。分离肝内非实质细胞并用流式细胞术检测。CD3 +细胞由F4 / 80highCD11b + Kupffer细胞分化而来。如图3C所示，CD3 +巨噬细胞约占Kupffer细胞总数的8.83 %。此外，通过肝脏免疫荧光染色观察到CD3 + F4 / 80 +巨噬细胞(图3D )，证实了sc RNA - seq的发现。接下来质疑这些CD3 +巨噬细胞是否存在于乙肝患者中。收集5例急性乙肝患者和10例慢性乙肝患者的肝组织活检标本。进一步对肝活检样本进行HE染色和多重荧光标记。HE染色显示急性期患者比慢性期患者肝脏浸润更多的免疫细胞。CD3 +巨噬细胞在急性乙肝患者( n = 5 ,图3E ,图S3C - F)的肝组织中检测到，而在CHB患者( n = 10 )的肝组织中未检测到，无论ALT (图3F和G )是否升高。这些发现提示CD3 +巨噬细胞数量增加。

4. 通过抗原、抗体和抗原特异性T细胞的综合作用产生CD3 +巨噬细胞

为了明确CD3 +巨噬细胞是否是由HBsAg特异性CD8 + T细胞和肝内巨噬细胞相互作用产生的，我们将HBsAg TCR转基因小鼠(杰克逊实验室, No.027510)的CD8 + T细胞和野生型小鼠的肝内巨噬细胞共培养。在共培养体系中加入HBsAg模拟HBV感染，结果显示单独HBsAg不能诱导CD3巨噬细胞(图4A )。考虑到这些细胞存在于快速清除或急性HBV感染的患者中，加入了抗HBsAg抗体( HBsAb )。结果显示，在HBsAg TCRtg CD8 + T细胞存在的情况下，HBsAg和HBsAb联合可高效诱导CD3 +巨噬细胞(图4A )。在没有T细胞存在的情况下，加入HBsAg和/或IFN - γ后，巨噬细胞没有向CD3 +表型转化。然后我们将TCRtg T细胞替换为野生型CD8 + T细胞。CD3 + F4 / 80 +细胞群也增加，但明显低于TCRtg T细胞组(图4C )。另一个问题是CD3 +巨噬细胞是来源于T细胞还是巨噬细胞，因为在肝脏中已经证明了CD14阳性的CD8 + T细胞的富集。因此，我们进行了transwell实验，在接种巨噬细胞的下室中发现了CD3 + F4 / 80 +细胞，而在含有T细胞的上室中没有发现CD3 + F4 / 80 +细胞(图4D )。此外，HBsAg和HBsAb剂量依赖性地诱导这些CD3 +巨噬细胞(图4E )。这一过程也依赖于HBsAg和HBsAb的结合，而单独加入HBsAg则没有影响(图4F )。为了进一步评估体内CD3 +巨噬细胞的生成，我们在Rag1敲除的(缺乏成熟的T、B细胞)、胸腺缺陷的裸鼠(缺乏成熟的T细胞)和muMt敲除的(缺乏成熟的B细胞)小鼠中构建了HBV快速清除模型。在高压水动力注射HBV B6质粒后的第4周至第5周之间处死小鼠。肝脏组织用F4 / 80和CD3抗体染色。CD3和F4 / 80双阳性细胞在野生型小鼠中可见(图4G )，而在Rag1基因敲除、胸腺缺陷裸鼠和mu Mt基因敲除小鼠(图4H、I、J)的肝脏中未见。这些数据表明CD3 +巨噬细胞来源于肝内巨噬细胞。

我们利用scRNA - seq对HBV暴露小鼠的肝脏免疫微环境进行了研究，揭示了长期驻留的CD3 +巨噬细胞具有吞噬和细胞毒性功能。这些发现有助于阐明肝内免疫应答在清除HBV中的作用，并为CHB的治疗建立潜在的治疗策略。

参考文献：

Wang C, Zai W, Zhao K, Li Y, Shi B, Wu M, Zhou X, Kozlowski M, Zhang X, Fang Z, Yuan Z, Potential role of liver resident CD3+ macrophages in HBV clearance in a mouse hepatitis B model, JHEP Reports, doi.org/10.1016/j.jhepr.2024.101323.