期刊：International Journal of Biological Macromolecules
影响因子：8.0
主要技术：单细胞核测序

导语

人类滋养层谱系的发育与胎盘发育和妊娠结果交织在一起，但支持这一过程的调节机制仍未被充分了解。本研究基于对人类母胎早期界面的单核RNA测序（snRNA-seq）分析，比较了滋养层在不同发育阶段的基因表达模式。我们的研究结果显示，在绒毛细胞滋养层（VCT）向合胞滋养层（SCT）过渡过程中，T-框蛋白3（T-Box Protein 3，TBX3）上调显著，但随着VCT向绒毛外滋养细胞（EVT）进展，TBX3下调。免疫荧光分析证实了TBX3在SCT中主要表达，在mki67阳性的VCT中部分表达，而在hla-g阳性的EVT中缺失，这与我们的snRNA-seq结果一致。利用永生化滋养细胞系（BeWo和HTR8/SVneo）和人原代滋养层细胞干细胞（hTSCs），我们观察到TBX3敲低通过RAS-MAPK信号阻碍SCT的形成，而TBX3过表达破坏了EVT的细胞骨架结构，通过抑制FAK信号阻碍EVT的分化。

关键技术
单细胞核测序

研究结果
1. TBX3在滋养层谱系发育过程中的表达特征
滋养层细胞产生10个亚组，包括VCT、VCT_fusing、SCT、VCT增殖（VCT-p）、细胞滋养细胞柱VCT（VCT_CCC）、EVT、血管内EVT（eEVT）、间质EVT（iEVT）和巨细胞（GCs）（图1A）。利用小提琴图和点图，分析显示，VCT标记TP63主要在VCT、VCT-p和VCT_CCC中表达，但在成熟的SCT和EVT中不表达。EVT标记物HLA-G在VCT向成熟EVT转化的过程中逐渐上调，而SCT标记物ERVW-1在SCT分化过程中主要上调。此外，增殖标志物MKi67主要在VCT-p和VCT_CCC中表达，证实了其增殖潜能（图1B-C）。这些滋养层标记物的表达模式为滋养层细胞的逻辑分裂成不同的亚群提供了依据。snRNA-seq分析揭示了，在VCT向SCT过渡过程中，TBX3逐渐上调，在VCT向EVT分化过程中下调（图1A-C）。这表明TBX3可能确实是人类滋养层谱系发展中的关键调控因子。

图1

2. TBX3主要在SCT中表达

为了证实TBX3在不同滋养层亚群中的表达谱，我们检测了其在人类妊娠早期胎盘（6-8周）中的表达和定位。免疫荧光结果显示，TBX3主要在SCT中表达，部分在mki67阳性的VCT中表达，而在hla-g阳性的EVT中明显不表达，与我们的snRNA-seq分析完全一致（图1，图2A）。结果显示，在引入FSK后，TBX3的激活与SCT标记物hCGβ的激活相一致（图2B）。TBX3的mRNA和蛋白的表达均证实了其一致性，表明FSK诱导的合胞化有效地触发了BeWo细胞中TBX3的表达（图2C-D）。此外，为了描述滋养层合细胞化过程中TBX3表达的时间进程，我们用25 μM的FSK处理BeWo细胞，并以交替的时间间隔收集样本。免疫荧光结果显示，随着诱导时间的增加，hCGβ和TBX3均逐渐被激活（图2E）。qRT-PCR和western blot分析进一步证实了这一时间趋势，证实了TBX3在滋养细胞合成细胞化过程中的逐步激活（图2F-G）。

图2

3. TBX3通过RAS-MAPK信号通路调控滋养层合胞化

利用慢病毒表达系统，建立了稳定的TBX3敲除的BeWo细胞。免疫荧光结果显示，与对照组添加25μM FSK（shN1、shN2）相比，TBX3敲低细胞（shT2、shT3）中hCGβ表达降低（图3A）。hCGβ的mRNA和蛋白表达进一步证实了TBX3敲低降低了FSKin诱导的BeWo细胞合胞化过程中hCGβ的表达（图3B）。主成分分析显示，shT1和shT3具有相似性，而shT2差异显著（图3C）。这使得我们推测，shT2 BeWo细胞可能正在经历脱靶效应。因此，排除了shT2组以进行进一步的实验。接下来，通过比较TBX3基因敲除组和对照组来分析DEGs，发现了264个DEGs（数据集S1；log2FoldChange≥1，P < 0.05）。在这些基因中，76个基因在TBX3基因下调组中表达上调，188个基因表达下调（图3D-E）。随后，我们对这些DEGs进行了功能聚类，GO分析显示，它们主要集中在生长因子结合和发育调控的生物学过程中；对DEGs进行了KEGG分析，找到关键通路：PI3K-AKT、JAK-STAT、轴突引导、多能性相关信号和RAS-MAPK信号通路（图3F）。

图3

4. MAPK抑制抑制了合胞滋养层的发育

免疫荧光结果显示，PI3K和MAPK抑制剂显著降低了hCGβ的表达，这与之前强调MAPK信号在调节滋养层合细胞化中的关键作用一致（图4A)。随后，我们深入研究了TBX3在BeWo细胞合胞化过程中对PI3K-AKT和RAS-MAPK信号通路的调控作用。Western blot结果显示，与对照组相比，TBX3敲低组RAS-MAPK信号通路的关键蛋白磷酸化ERK的表达显著降低。磷酸化的AKT是PI3K-AKT信号通路的关键蛋白，但AKT的表达并不受TBX3敲低的显著影响（图4B）。PD0325901也抑制了FSK处理的BeWo细胞中TBX3的表达（图4C-D）。这提示在SCT分化过程中，TBX3和MAPK信号通路之间可能存在正反馈调节关系。

图4

5. TBX3损害HTR8/SVneo细胞的迁移和侵袭

从典型的间充质梭形形态向聚集的上皮样细胞结构转变结果来看，TBX3 OE诱导了HTR8/ SVneo细胞的转化，导致其发生表型变化（图5A）。为了评估TBX3对HTR8/SVneo细胞侵袭特性的影响，我们进行了一项基于基质细胞的侵袭实验。显示TBX3 OE HTR8/SVneo细胞通过Matrigel侵袭的能力降低，与对照组相比下降了80%（图5B）。此外，伤口愈合实验表明，TBX3 OE阻碍了HTR8/SVneo细胞的迁移（图5C）。进一步研究TBX3是否影响与EVT迁移和侵袭相关的基因。qRT-PCR结果显示，TBX3 OE HTR8/SVneo细胞中间充质细胞和EVT标记物的表达下调（图5D）。Western blot与qRT-PCR的结果相一致（图5E）。CCK8检测表明，TBX3显著抑制了HTR8/SVneo细胞的增殖，导致OD450值降低了约50%（图5F）。TBX3对EdU阳性率的影响相对较小，导致EdU阳性率降低了约20%（图5G）。

图5

6. TBX3通过FAK信号通路调控HTR8/SVneo细胞的迁移和侵袭

为了深入研究TBX3影响EVT的调控机制，我们进行了转录组测序。将TBX3 OE组与对照组进行比较，发现了1124个deg（数据集S4；log2FoldChange≥1，P < 0.05）。其中，TBX3 OE组有426个基因表达上调，而698个基因表达下调（图6A）。值得注意的是，TBX3 OE组与对照组之间这些deg的表达模式存在显著差异（图6B）。KEGG通路分析富集到PI3K-AKT、轴突引导、RAS-MAPK、病灶黏连（FAK）和钙信号传导（图6c和数据集S6）；划痕实验显示，所有这些抑制剂都损害了HTR8/SVneo细胞的迁移能力，这与在TBX3 OE HTR8/SVneo细胞中的观察结果一致（图6D-E）。有趣的是，磷酸化的AKT和磷酸化的ERK的表达明显增加。这表明TBX3对RAS-MAPK信号通路的调控作用在SCT和EVT中都是保守的，而对PI3K-AKT信号通路则不保守（图6F）。免疫荧光结果也表明，TBX3可以抑制磷酸化FAK的表达，破坏HTR8/SVneo细胞的细胞骨架结构（图6G），这些发现支持了类似的概念，即阻断FAK信号可导致细胞骨架结构的损伤。

图6

 

参考文献：

Su W, Saravia J, Risch I, Rankin S, Guy C, Chapman NM, Shi H, Sun Y, Kc A, Li W, Huang H, Lim SA, Hu H, Wang Y, Liu D, Jiao Y, Chen PC, Soliman H, Yan KK, Zhang J, Vogel P, Liu X, Serrano GE, Beach TG, Yu J, Peng J, Chi H. CXCR6 orchestrates brain CD8+ T cell residency and limits mouse Alzheimer's disease pathology. Nat Immunol. 2023 Oct;24(10):1735-1747. doi: 10.1038/s41590-023-01604-z. Epub 2023 Sep 7. PMID: 37679549.