期刊：Cancer Cell  

影响因子：50.3

主要技术：单细胞转录组测序（scRNA-seq）

 

导语

这篇文章通过单细胞测序技术绘制了新辅助免疫治疗错配修复蛋白缺陷或微卫星不稳定型高（dMMR/MSI-H）结直肠癌肿瘤微环境改变的动态图谱，揭示了dMMR/MSI-H肠癌对PD-1治疗耐药的潜在机制是IL1B+ Mono主导的炎性环境，并为dMMR/MSI-H结直肠癌提供了新的治疗靶点。

 

技术方法

单细胞转录组测序（scRNA-seq）
 

研究结果

1.新辅助免疫治疗的d-MMR/MSI-H结直肠癌单细胞表达图谱

他们对来自19名患者的40份肿瘤和邻近正常组织样本进行了scRNA-seq，以表征免疫检查点抑制剂（ICI）治疗期间免疫和基质细胞的细胞和分子特征以及动态变化（图1A）。整合所有样本，聚类到六种广泛的细胞类型（图1B）。通过治疗前后样本的比较分析，发现 +ICI/pCR 组中 T/I/NK 细胞、成纤维细胞和内皮细胞的比例有显著增加，反映出T/I/NK细胞和基质细胞在ICI治疗中的重要作用（图1C）。进一步聚类分析结果显示，异质免疫细胞和基质细胞亚型表现出不同的分子特征，表明其独特的细胞身份（图1E）。

2. CD8 T细胞毒性和增殖程序中与免疫治疗相关的变化

将CD8+ T细胞进一步划分为上皮内淋巴细胞（IEL）、粘膜相关不变性T （MAIT）、效应记忆（Tem）和两个组织常驻记忆（TRMs）亚群（图2A、图2B）。为探索ICI对整体CD8+ T细胞转录组的影响，GSEA富集分析结果显示，细胞毒性、耗竭和增殖基因标签的分布趋势与ICI治疗相关，与-ICI组相比，+ICI/pCR组富集细胞毒性标签，而+ ICI/非 pCR 组富集耗竭和增殖标签（图2F）。接下来分析了 CD8+T 细胞簇中细胞毒性、耗竭和增殖基因的表达，以探索与 ICI 反应相关的关键细胞类型（图2C、图2E和图2G）。之后作者团队进一步分析了CD8+ T集群频率的变化，以解决肿瘤消退是否主要由CD8+ T细胞驱动。ICI 处理诱导 pCR 反应中 CD8+Tem 和CD8+Trm-mitotic 的细胞比例发生了显著变化，而 CD8+Trm 细胞的比例不变，说明 CD8+T细胞的细胞毒性和增殖能力在新辅助 ICI 治疗中起重要作用（图2D）。

3. ICI治疗相关特征变化和CD8+Trm细胞的转录组改变

对于 pCR （病理完全缓解）肿瘤，ICI治疗增加了CD8+ Tem细胞的比例，并在细胞水平上增加了抗原呈递过程和特征性IFN-g反应基因的表达（图 3A）。治疗后，活化 CD8+ T 细胞状态的 HLADR 基因的表达增加主要存在于处理后的 CD8+ Tem 细胞中（图 3B）。对于瞬时 CD8+ Trm 细胞，抗肿瘤免疫程序在 ICI 处理后上调，包括抗原受体介导的信号通路和淋巴细胞介导的免疫程序（图 3C）。ICI处理后CD8+ Trm细胞的CD8+ Tem特征升高，CD8+ Trm-mitotic特征降低（图3D），表明ICI可能促进CD8+ Trm细胞向CD8+ Tem细胞转化，阻断CD8+ Trm细胞向CD8+ Trm-mitotic细胞的转化，导致 CD8+ Tem 细胞增加和 CD8+ Trm-mitotic细胞减少，最终导致整体抗肿瘤免疫力增强。

4. ICI治疗后 CD4+ Th和 CD20+ B细胞协同扩增

在 CD4+ T 簇（图 4A 和 4B）中，研究发现 ICI 处理后 pCR 样本中 CD4 调节细胞（Tregs） 分数显着降低（图 4D），这一结果也在mIHC中得到了证实（图 4C）。这与之前关于肺癌的研究一致，肿瘤内 Treg 表达 PD-1 （PDCD1）和CTLA-4 （CTLA4），可抑制抗肿瘤免疫反应。这些结果表明成功的ICI治疗通过减少 CD4+ T 细胞中Tregs的比例，减轻了对免疫系统的抑制作用。相关性分析发现，CD40LG+ CD4+ Th细胞与CD8+ Trm-mitotic细胞呈负相关（图4H），表明由CD40LG+ CD4+ Th细胞表达的有效辅助信号可能会损害CD8 T细胞耗竭程序。通过比较 ICI 和 +ICI/pCR 组，他们发现CD20+ B 细胞的比例显着增加（图 4F），与其 CD40 的表达一致。这些数据表明 B 细胞可能参与由 PD-1 阻断引起的 TIME重塑，而与 B 细胞抗体驱动的免疫无关。通过分析治疗前后B细胞的转录组差异，+ICI/pCR组表现出抗原受体介导的信号通路和T细胞激活通路相关基因的富集（图4I）。表明CD20+ B细胞与CD8+相关T 细胞状态，可能有助于向 pCR 的状态转变。Cellchat分析显示，与ICI组相比，+ICI/pCR组中CD4+ Th细胞和Bgc之间的通讯数量和强度增加（图4K）。在+ICI/pCR组中，Bgc和CD4+ Th细胞之间的CD40-CD40LG相互作用更强（图4J）。这些结果表明，在ICI治疗过程中，CD4+ Th细胞和Bgc细胞之间的相互作用可能归因于 ICI 治疗期间的抗肿瘤免疫。

5. ICI治疗后髓系细胞中的促炎程序减少

此外，对8,469个髓系细胞进行了再聚类，共发现了10个簇，包括巨噬细胞、树突状细胞和单核细胞（图5A），根据单核细胞标记物的高表达、巨噬细胞标记物和HLA基因的低表达，确定了两个单核样簇（IL1B+ Mono，FCN1+ Mono）（图5B）。他们进一步分析了ICI治疗后髓系细胞亚群的重塑，发现IL1B+ Mono细胞的比例显著减少（图5C）。IL1B+ CD14+ CD68单核样细胞被证实浸润在d-MMR/MSI-H结直肠癌肿瘤中，VEGFA细胞因子散布在细胞周围（图5E）。通过将这些细胞与其他髓系细胞进行比较，他们发现IL1B+ Mono细胞通过高表达促炎因子IL6、IL1A、IL和中性粒细胞趋化因子CXCL8、CXCL2、CXCL1、CCL2和CCL4表现出炎性单核细胞的特征（图5D）。

6. ICI治疗对基质细胞的重塑

肌成纤维细胞和CXCL12+ Fibro 在 ICI 处理后 pCR 样本中显着增加（图 6B）。肌成纤维细胞显示片状胶原蛋白（COL4A1、COL4A2）的特异性表达，它们是上皮基底膜的关键成分（图 6A）。与CXCL12+Fibro的增加一致，治疗后CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞中CXCR4上调表达（图 6C）。Cellchat分析结果显示，肌成纤维细胞表达的CXCL12与淋巴细胞群表达的CXCR4之间的相互作用在+ICI/pCR组中显著富集（图6F），表明CXCL12

+Fibro可能通过CXCL12-CXCR4轴参与淋巴细胞的招募。在实现pCR（完全病理学反应）的患者中，内皮细胞（EC）中HLA-DRA+ EC的数量显著增加（图6H）。HLA-DRA+ EC 表达趋化因子受体 D6、SELP、SELE 和 VCAM1（图 6G），这些分子调节白细胞通过血管壁的迁移。HLA-DRA+ EC群体中发现高表达主要组织相容性复合体II类分子（MHCII）的表面分子HLA-DR（图6D），这允许抗原呈递给CD4+ T细胞。HLA-DRA+ EC 与 B 细胞和 CD4+ T 细胞的联系更多，表明它在协助免疫激活方面发挥着重要作用。

7. 抗肿瘤炎症的缓解与治疗反应相关

炎症被认为与肿瘤的发展密切相关，炎症持续的非消退状态可能促进肿瘤的形成和发展。ICI治疗引起促炎性髓系亚群（IL1B+Mono）和促炎性基质亚群（CCL2+Fibro）的显著减少（图7A和7D），表明炎症得到了缓解。此外，IL1B+Mono与CD8+ Trm-mitotic细胞的丰度呈正相关，并且始终与增殖和耗竭过程呈正相关（图7C）。这些结果表明CD8 TRMs与炎症信号通路之间存在正反馈回路，并且炎症与CD8+ T细胞的耗竭程序相关。然而，与pCR相比，非pCR组在ICI治疗后促炎性细胞（IL1B+ Mono、CCL2+ Fibro）并没有显著减少。在与ICI疗效相关的细胞中，炎症相关Tregs、CD8+ Trm-mitotic细胞和IgA血浆B细胞也在+ICI/non-pCR组中富集（图7A）。

 

结论

该研究针对局部晚期的d-MMR/MSI-H结直肠癌，观察了在免疫检查点抑制剂（ICI）治疗期间关键免疫细胞和基质细胞亚群的动态变化。非转移性新辅助治疗队列能清楚地观察成功的免疫治疗引起的特定变化，从而确定d-MMR/MSI-H CRC 免疫治疗的分子机制和残留肿瘤细胞的免疫逃逸机制。

 

参考文献：

Li J, Wu C, Hu H, Qin G, Wu X, Bai F, Zhang J, Cai Y, Huang Y, Wang C, Yang J, Luan Y, Jiang Z, Ling J, Wu Z, Chen Y, Xie Z, Deng Y. Remodeling of the immune and stromal cell compartment by PD-1 blockade in mismatch repair-deficient colorectal cancer. Cancer Cell. 2023 May 9:S1535-6108(23)00137-X.