期刊：Journal of autoimmunity

影响因子：12.8

技术服务：scRNA-Seq、TCR V(D)J、CyTOF

 

导语

儿童获得性再生障碍性贫血(aquired aplastic anemia，aAA)是一类T细胞异常激活攻击骨髓正常造血干/祖细胞导致全血细胞减少的骨髓衰竭性疾病。然而，异质性T淋巴细胞群复杂性背后的功能机制决定因素及其与临床结果的相关性仍有待阐明。为了揭示异质性骨髓浸润免疫环境中的功能障碍机制，并研究其与造血干/祖细胞的致病性相互作用。综合利用质谱流式技术、单细胞转录组测序技术和单细胞免疫组库测序技术，对严重型AA (SAA)患者免疫治疗前后的BM单核细胞进行了分析。分析结果显示Th17分化倾向的CD4+CAMK4+ naïveT细胞群，显示 IL-6/JAK3/STAT3通路的激活，高血浆IL-6水平是对基于抗胸腺细胞球蛋白的免疫抑制治疗产生延迟造血反应的独立危险因素。因此，IL-6可作为SAA的一个潜在治疗靶点，值得进一步研究。

研究技术

scRNA-Seq、TCR V(D)J、CyTOF

技术路线

 

研究结果

为了探索儿童 SAA 病例在诊断和治疗后阶段的 BM 细胞组成变化(HSPC和成熟细胞)，研究人员进行了质谱流式技术(CyTOF )分析。比较了9个诊断的 SAA 样本 (Dx-SAA)、3个ITS后的 SAA 样本 (IST-SAA) 和4个儿科健康捐赠者 (HD) 的 BMMC 样本(Fig 1A)。预定义的标记组，专门设计用于表征BMMC的组成和功能，包括关键表面抗体(n=31)和针对关键蛋白激酶磷酸化形式的抗体(n=11)。对来自超过8,321,000个BMMC的再处理数据通过降维算法进行了聚类和可视化(Fig1B)。根据典型谱系标记的表达进行细胞类型注释，划分为干/祖细胞、粒细胞、红细胞和免疫亚群(单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、NK细胞)共8个主要功能类别(Fig1C-D)。用t-SNE 图显示了每个类别的特征基因的表达水平(Fig 1E)。研究人员进一步将不同阶段的SAA患者的细胞特征与健康的对照组进行比较，并观察Dx-SAA样本中BMMC分布的显着改变(Fig 1F)。值得注意的是，与IST-SAA后和HD样本相比，Dx-SAA 样本中所有非免疫亚群以及免疫亚群中的单核细胞和树突状细胞的比例显着下降，而T细胞的比例显着升高。这些变化可能与免疫介导的AA病理生理机制有关(Fig 1G)。

1. T细胞亚群中倾斜的免疫成分可区分Dx-SAA患者中独特的CD4+ naïve T细胞表型

为了更详细地了解SAA发病时潜在的活跃的T细胞亚群的免疫状况，研究人员对 CD3+ T亚群

进行了重新聚类，以剖析亚群中的组成差异(Fig 2A)。使用成熟的标记来区分 CD3+ T 亚群(Fig 2B)，将27 个簇重新聚集，其表型对应CD4+、CD8+、γ/δ Τ(gdT)、双阴性T (DNT) 细胞四种主要细胞类型(Fig 2C)。从病程角度考察其组成，与HD和IST-SAA 样本进行比较发现Dx-SAA样本中CD4+ T细胞显着增加，而gdT细胞显着减少，这表明 Dx-SAA 样本中T细胞的增加是由于 CD4+ T细胞显着激活所致(Fig 2D- E)。值得注意的是，在原始50个簇的11个CD4+ T细胞簇中26和27簇在Dx-SAA 样本中的T细胞总数高于HD样本中的T细胞总数，但在IST治疗后有所减少(Fig 2F)。根据 CyTOF 特征以及回顾性队列的流式细胞术验证，在这些亚群中发现了相对较高水平的 CD45RA 和 CCR7 表达，表明Dx-SAA样本中CD3+CD4+ BMMC 亚群中naïve T细胞的比例较高(Fig 2G)。此外，与其他簇相比，这些细胞中NFκB (pNFκBS529)和STAT3 (pSTAT3Y705)的磷酸化水平要高得多(Fig 2G-H)。这些结果表明，具有不同表型的非典型CD4+ naïve T细胞亚群可能与SAA发病机制相关。

2. 通过scRNA-seq鉴定与SAA中CD4+CAMK4+ naïve T细胞相关的调节因子

为了进一步阐明不同CD4+ naïve T细胞在儿童AA中的确切作用，研究人员对来自上述5例 Dx-SAA样本和2例HD样本的BMMC中分离的CD3+ 进行了基于液滴的高通量5'-单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 和配对T细胞受体测序(scTCRseq)(Fig 3A)。利用基因特征将质控后得到的79,027个细胞的20个簇分类为14种T细胞类型(Fig 3B-D)。有趣的是，CCR7表达水平最高的簇被鉴定为表达高水平的钙/钙调素依赖性蛋白激酶IV (CAMK4) 的CD4+ naïve T细胞(Fig 3E)。与CD4+效应

细胞一起，这些细胞被发现是所有SAA样本中最显著增加的T细胞类型(Fig 3F)。

由于转录因子被认为是造血谱系定型和特异性的关键决定因素，研究人员继续研究了14种T细胞类型中关键转录因子的表达(Fig 4A)。结果发现，转录因子RUNX1、STAT3、IKZF1、MEF2A和ATF6在CD4+CAMK4+ naïve T细胞和CD4+效应T细胞中的表达均显著高于其他T细胞亚群。相反，其他转录因子ENO1、TAF7和YBX1，在这两个CD4+细胞群体中的表达较低。(Fig 4B)。研究人员还利用scTCR-seq分析了SAA开始时的TCR克隆性，但是与预期相反，并没有观察到SAA患者

的克隆性TCR扩增，来自SAA患者的CD4+CAMK4+ naïveT细胞实质上缺乏TCR表达。这些结果表明，具有高水平某些转录因子和调节因子的CD4+CAMK4+ naïveT细胞可能与SAA发育过程中的异常免疫激活有关。

3. SAA患者外周血中CD4+T淋巴细胞信号异常的研究

为了探讨CD4+CAMK4+naïveT细胞在免疫失调中的作用，研究人员通过对HD和Dx-SAA样本的CD4+T细胞亚群进行拟时序分析。分析表明，Dx-SAA中CD4+ T细胞的分化轨迹与HD样本中的相似。尽管如此，与HD相比，Dx-SAA观察到CD4+CAMK4+ naïveT细胞显着增加，支持 SAA 中 CD4+CAMK4+ naïveT细胞与失调的 CD4+ T淋巴细胞征之间的假定相关性(Fig 5A-B)。为了进一步确定非典型CD4+ naïve T细胞过度激活的分子基础，研究人员通过Dx-SAA样本中CD4+CAMK4+ naïve T细胞和典型CD4+CAMK4- naïve T细胞之间的成对比较，SAA 样本的 CD4+CAMK4+ naïve T细胞和CD4+ 效应T细胞与HD样本的比较来评估转录组改变，这些比较分别产生了 598、559 和 325 个差异表达基因(Fig 5C-E)。值得注意的是，代表信号通路的关键基因，例如替代剪接体调节因子(SF3B1、DDX5、FUS)、TCR 信号基因(ITK、PTPRC、ZAP70)和 Th17 细胞分化基因(JAK3、STAT3、IL6ST)在SAA 患者中的CD4+CAMK4- naïve T和CD4+ 效应细胞持续过度激活，也表明 SAA 中 CD4+ T 辅助细胞整体激活和潜在的 Th17 极化(Fig 5F)。与这一发现一致，对30例Dx-SAA 患者和23例HD的CD4+ BMMC 中的 STAT3pY705 和 STAT3pY727 进行磷酸流式细胞术分析，强烈表明 SAA 发生时Th17极

化CD4+ naïve T 细胞中JAK3/STAT3通路的异常激活(Fig 5G-H)。

4. 基线血清细胞因子IL-6水平高可预测SAA患者对IST的造血反应延迟

根据CD4+ T辅助细胞的个体发育研究，IL-6是诱导STAT3激活的Th17细胞从CD4+ naïve T 细胞分化的关键刺激物。研究人员通过研究 231例SAA 儿童患者的IL-6水平与预后之间的关联来阐明SAA 中基线IL-6 水平的临床意义。所有患者均接受结合兔抗胸腺细胞球蛋白(ATG)和环孢素的IST方案，结合中位时间为69个月的疗效随访及多因素回归分析，将基线IL-6水平作为IST后3个月应答的一个重要潜在决定因素(Fig 6A)。血清IL-6水平较高(≥120 pg/ml)的患者似乎表现出较晚的总体反应(Fig 6B-D)。特别是，结合与IST反应相关的假定因素(包括年龄、性别、诊断严重程度、病程、ATG剂量、初始三系血细胞计数以及基线IL-6水平)的多变量分析一致地将IL-6≥120pg/ml定位为导致IST反应较差和三系恢复延迟的独立不利危险因素(Fig 6F-I)。

 

结论

该研究利用单细胞转录组和CyTOF质谱流式方法对儿童SAA骨髓造血细胞进行了深入的表型分析，揭示了异常的免疫微环境在儿童SAA免疫介导的造血功能衰竭中的作用。通过在单细胞水平转录组、免疫组及蛋白质组水平上发现CD4+CAMK4+ naïve T细胞IL6/JAK3/STAT3的激活及潜在的Th17极化是SAA免疫失衡的重要分子机制之一。最后通过大规模的临床队列的疗效随访及多因素分析，为后续研究针对儿童SAA患者的免疫抑制联合靶向治疗的干预策略提供了新思路。

参考文献：

Zhang J, Liu T, Duan Y, et al. Single-cell analysis highlights a population of Th17-polarized CD4+ naïve T cells showing IL6/JAK3/STAT3 activation in pediatric severe aplastic anemia. J Autoimmun. 2023 Apr;136:103026. doi: 10.1016/j.jaut.2023.103026. Epub 2023 Mar 29. PMID: 37001436.