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上海伯豪生物技术有限公司
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伯豪生物-10X Genomic Visium 空间基因表达
人阅读 发布时间:2020-04-03 14:12
空间转录组(Spatial Transcriptomics)就是将基因的表达情况与关注的组织切片的免疫化学染色图像进行整合,从而将组织内不同细胞的基因表达信息定位到组织的原始空间位置上去,进而直接观测组织中不同部位功能区基因表达的差异。空间转录组技术利用了常规的原位技术和组学技术两方面的优势。
(1)准确定位:探针有效定位组织中 RNA 空间位置,实时了解组织中的转录组天然状态。
(2)高效易行:芯片设计简单易操作、重复性高、可快速获得高分辨率空间转录组信息。
(3)适用性广:有效应用于发育生物学、肿瘤生物学、脑神经科学、植物研究等各生物学领域。
图 6 组织速冻和 OCT 包埋示意图
2、冷冻切片切、组织样本质控及贴片
1、甲醇固定
2、H&E 染色
3、组织透化
4、成像
获得测序数据后,首先利用 Space Ranger 软件可以自动化的对图像进行处理、数据比对和 Barcode 处理。另外一个软件 Loupe Cell Browser 是一个适用于 Windows 和 MacOS 的桌面应用程序,它可以快速、轻松地可视化和分析 10X Visium 数据。伯豪生物除了提供 spot 基因数和 UMI 数统计、切片 spot 聚类和聚类亚群 marker 基因分析等基础和高级分外,同时还提供个性化分析,如特定 pathway 功能富集分析等。
表 1 10X Genomic 空间转录组已发表文献
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10X Genomic Visium 技术优势
空间转录组学技术是转录组学研究领域的新方向,也是研究细胞异质性方面的新方法。(1)准确定位:探针有效定位组织中 RNA 空间位置,实时了解组织中的转录组天然状态。
(2)高效易行:芯片设计简单易操作、重复性高、可快速获得高分辨率空间转录组信息。
(3)适用性广:有效应用于发育生物学、肿瘤生物学、脑神经科学、植物研究等各生物学领域。
10X Genomic Visium 技术原理
将冷冻组织切片放置在 10X Genomics Visium 芯片的捕获区域内,进行 HE 染色和成像后,对组织切片进行透化处理,细胞内的 mRNA 释放,从而被芯片上带有 oligo-dT 的探针捕获,并且每个探针都带有特异的位置信息(Spatial barcode),然后以 mRNA 为模版进行 cDNA 合成,构建文库后再通过测序,获得基因表达信息的同时,每一条测序 reads 因带有 Spatial barcode,从而能够获得基因表达的位置信息。
图 2 10X Genomics Visium 空间转录组技术的原理
10X Genomic Visium 实验流程
图 5 10X Genomic Visium 实验流程
第一步:样品制备
1、新鲜组织样本速冻和 OCT 包埋图 6 组织速冻和 OCT 包埋示意图
图 7 组织速冻和 OCT 包埋
2、冷冻切片切、组织样本质控及贴片
图 8 组织切片及贴片
第二步:组织优化
组织优化芯片包含 8 个捕获区域,其中 6 个区域分别设置 6 个不同的透化时间梯度,另外两个区域 1 个为不加透化剂的阴性对照,另 1 个为阳性对照,不放组织切片,而是直接加入 RNA。其实验流程为:固定→染色→明场拍照→组织透化→荧光 cDNA 合成→组织移除→荧光扫描,根据荧光强度判断最优(最亮)的透化时间。1、甲醇固定
2、H&E 染色
图 9 甲醇固定与 HE 染色
3、组织透化
4、成像
图 10 明场成像和荧光成像
第三步:正式实验
图 11 cDNA 合成、扩增及文库制备流程图
10X Genomic Visium 数据分析
空间转录组数据分析的核心是根据每个芯片上每个 spot 的基因表达信息进行聚类,然后将 spot 根据坐标位置序列放回到组织的图像上,同时可以对每个 gene 在组织上表达的空间位置进行定位。获得测序数据后,首先利用 Space Ranger 软件可以自动化的对图像进行处理、数据比对和 Barcode 处理。另外一个软件 Loupe Cell Browser 是一个适用于 Windows 和 MacOS 的桌面应用程序,它可以快速、轻松地可视化和分析 10X Visium 数据。伯豪生物除了提供 spot 基因数和 UMI 数统计、切片 spot 聚类和聚类亚群 marker 基因分析等基础和高级分外,同时还提供个性化分析,如特定 pathway 功能富集分析等。
图 12 每个 spot 特异表达的基因数统计
图 13 聚类结果及切片 spot 位置分布展示
图 14 所有 cluster 选择 top5 基因绘制小提琴
图 15 特定 pathway 功能富集分析
10X Genomic Visium 应用方向
1、应用方向
空间位置信息,或者细胞在组织中天然的状态在研究过程中其实具有十分重要的价值,特别针对某些研究领域,如发育生物学(不同位置的细胞接受不同的信号浓度梯度、响应不同的外界刺激,具有不同的发育命运)、肿瘤生物学(肿瘤组织与癌旁组织的区别,肿瘤细胞侵润过程中肿瘤细胞的变化与对正常细胞的影响,肿瘤转移的不同过程阶段等)、脑神经科学(不同脑区位置的神经元结构、神经连结,中间神经元投射,突触前后,神经胶质相互影响等等),细胞来源的位置信息是极为关键的决定因素。常见空间转录组的应用方向主要在肿瘤学,免疫学,发育生物学,神经科学及病理学等方向。
图 16 空间转录组的应用方向
表 1 10X Genomic 空间转录组已发表文献
编号 | 期刊 | 年份 | 物种 | 研究方向 | 题目 |
1 | Cell | 2019 | 人 | 胚胎心脏 | A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart[4] |
2 | Science | 2019 | 人、小鼠 | 肌萎缩性侧索硬化症 | Spatiotemporal dynamics of molecular pathology in amyotrophic lateral sclerosis[5] |
3 | Scientific Reports | 2019 | 人 | 关节炎 | Exploring inflammatory signatures in arthritic joint biopsies with Spatial Transcriptomics[6] |
4 | Bioinformatics | 2019 | 方法 - 分析和可视化工具 | ST viewer: a tool for analysis and visualization of spatial transcriptomics datasets[7] | |
5 | Nature Communications | 2018 | 人 | 前列腺癌 | Spatial maps of prostate cancer transcriptomes reveal an unexplored landscape of heterogeneity[8] |
6 | Bioinformatics | 2018 | 方法 -ST-Spot 检测器 | ST Spot Detector: a web-based application for automatic spot and tissue detection for spatial Transcriptomics image datasets[9] | |
7 | Scientific Reports | 2018 | 人 | 牙周炎 | Gene expression profiling of periodontitis-affected gingival tissue by spatial transcriptomics[10] |
8 | Cancer Research | 2018 | 人 | 皮肤恶性黑色素瘤 | Spatially Resolved Transcriptomics Enables Dissection of Genetic Heterogeneity in Stage III Cutaneous Malignant Melanoma[11] |
9 | Nature Protocols | 2018 | 方法 - 条码固相 RNA 捕获 | Barcoded solid-phase RNA capture for Spatial Transcriptomics profiling in mammalian tissue sections[12] | |
10 | Nature Plants | 2017 | 拟南芥、杨树云杉 | 花序、叶芽和雌球果发育 | Spatially resolved transcriptome profiling in model plant species[13] |
11 | Scientific Reports | 2017 | 人 | 心脏 | Spatial detection of fetal marker genes expressed at low level in adult human heart tissue[14] |
12 | Science | 2016 | 方法 - 芯片技术 | Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics[15] | |
13 | Nature Communications | 2016 | 方法 -MASC-seq | Massive and parallel expression profiling using microarrayed single-cell sequencing[16] | |
14 | Scientific Reports | 2016 | 方法 - 文库制备 | An automated approach to prepare tissue-derived spatially barcoded RNA-sequencing libraries[17] |
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